IMC I04 Ligation

Last Modified:2018-09-09 (日) 17:42:40
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目的と概要

ライゲーションは、分子クローニングを実行するために不可欠な実験です。IMCでは、注釈付塩基配列を含む様々な塩基配列同士を実際のクローニング実験と同様に結合して、その産物を生成します。すべての注釈はライゲーション産物にも正しく継承され、かつその産物も元の塩基配列と同様にIMCの多くの機能を使って解析することができます。

機能

  • 塩基配列同士をその末端形状が相補的に一致する場合は、ライゲートし、1つの塩基配列にします。
  • GenBankやEMBL形式の注釈付塩基配列も同様にライゲーションが可能で、それらの注釈はライゲーション生成物に正しく継承されます。
  • 2つの塩基配列の両末端の形状が相補的に一致する場合は、セルフライゲーションにより環状塩基配列を生成します。
  • カレントフォルダーにロードされているすべての塩基塩基配列の末端形状を表示します。

    IMC5201_C620_0025.png

  • ライゲーション産物として生成される塩基配列は、元の塩基配列と同様に解析することができます。

制限事項

  • 現在、3個以上の塩基配列を同時にライゲーションすることはできません。

アルゴリズム

  • IMC上で制限酵素切断された配列には、末端の状態を示す特殊なFeature KeyとQualifierが生成されます。

操作方法

使用可能ファイル形式

結果出力

  • 注釈付塩基配列ファイルが生成され、カレントフォルダーにロードすることができます。

準備

操作対象の選択

  • カレントフォルダー上にロードされている塩基配列に対して操作実行できます。

塩基配列末端形状の表示確認方法

  1. 目的の塩基配列をカレントフォルダーにロードします。
  2. Menu --> Cloning --> Ligationを選択します。あるいは、ツールボックスのLigationボタンをクリックします。
    • IMC5201_C620_0022.png
    • IMC5201_C620_0023.png
    • Ligationダイアログが表示されます。ここには、カレントフォルダーにロードされているすべての塩基配列のリストが表示されます。
    • IMC5201_C620_0024.png

セルフライゲーション

  • ここでセルフライゲーション対象とする塩基配列は直接更新されます。もし元の配列をそのまま保持したい場合は、別名で保存した配列をライゲーション対象とします。
  1. 線状塩基配列をカレントフォルダーにロードします。
    • 線状塩基配列がない場合は、環状塩基配列をロードし、それを制限酵素により開環し、線状化します。これにより末端が相補的な塩基配列が生成されます。
  2. Menu --> Cloning --> Ligationを選択します。
    • ライゲーション反応ダイアログが表示されます。
    • IMC5201_C620_0024.png
  3. セルフライゲーションチェックボックスにチェックします。
    • 2ndカラムがInactiveとなります。
  4. セルフライゲーション対象とする塩基配列の1stカラムのラジオボタンをオンにして選択します。
  5. Ligationをクリックします。
    • 確認メッセージが表示されます。
    • IMC5201_C620_0028.png
  6. はい(Y)をクリックします。
    • 完了メッセージが表示され、線状のアイコンが環状に変化し、環状化が完了します。
    • IMC5201_C620_0029.png
  7. 了解をクリックします。
    • その塩基配列の末端形状が相補的でなくとも、強制的にセルフライゲーションしたい場合は、End Checkチェックボックスのチェックを外します。

2個の塩基配列同士のライゲーションを実行する

  1. カレントフォルダーに2個の塩基配列をロードします。
  2. Menu --> Cloning --> Ligationを選択します。あるいは、ツールボックスのLigationボタンをクリックします。
    • Ligationダイアログが表示されます。ここには、カレントフォルダーにロードされているすべての塩基配列のリストが表示されます。
  3. 片方の配列の1stラジオボタンをオンにます。
  4. もう一方の塩基配列の2ndラジオボタンをオンにします。
  5. Ligationをクリックします。
    • 確認メッセージが表示されます。
    • IMC5201_C620_0028.png
  6. はい(Y)をクリックします。
    • Ligation Listダイアログが表示されます
    • IMC5201_C620_0032.png
    • 2個の配列の両末端同士が相補的の場合は、2個の生成物が表示されます。両方とも環状塩基配列となります。
    • 2個の配列の片末端同士だけが相補的の場合は、1個の生成物が表示されます。この配列は線状塩基配列となります。
  7. 生成物にチェックします。
    • IMC5201_C620_0033.png
  8. Loadをクリックします。
    • 完了メッセージが表示されます。
    • ライゲーションできない場合は、「ライゲーション不可メッセージ」が表示されます。
  9. 了解をクリックします。
    • チェックされた生成物がカレントフォルダーにロードされます。
    • カレントフォルダーにロードされたライゲーション生成物に対してIMCのさまざまな解析を実行できます。
    • IMC5201_C620_0036.png

インサートチェックに最適な制限酵素を表示

  • インサートされる塩基配列がどちらの方向に挿入されたかを判定するのに最適な制限酵素のリストを表示します。
  1. Ligation Listダイアログの生成物両方にチェックします。
    • IMC5201_C620_0032.png
  2. Ligation Listダイアログの下部にあるSearch Enzyme...をクリックします。
    • インサートチェックに最適な複数の制限酵素のリストが表示されます。
    • IMC5201_C620_0048.png
    • 制限酵素のリストには以下の項目が表示されます。
      • 制限酵素名称
      • 認識配列
      • 認識部位の位置
      • 認識部位の位置
  3. 制限酵素を選択(複数選択可能)してから、Gel Electrophoresisをクリックします。
    • 選択された制限酵素によるライゲーション生成物の一次元電気泳動のシミュレーション図が描画されます。
    • IMC5201_C620_0049.png
  4. 複数ページにわたる場合は、Next Pageをクリックします。

ライゲーション生成物のプラスミドマップを描画(Plasmid Map機能を使用します)

  1. ライゲーション生成物をカレントフォルダーにロードします。
  2. Directory Tree上でその生成物塩基配列をクリックします。
    • その生成物のフィーチャーマップが表示されます。
  3. Menu --> Cloning --> Plasmid Mapを選択します。あるいはツールボックスのPlasmid Mapをクリックします。
    • 実行確認メッセージが表示されます。
  4. はい(Y)をクリックします。
    • Select Insert Areaダイアログが表示されます。
  5. Insertされる領域を選択し、Setをクリックします。

Tips

バグ情報

未修正のバグ

修正済のバグ

最新追加・変更機能

関連機能

  • 制限酵素処理
  • ゲル電気泳動

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